Корж В. П.
Институт молекулярной и клеточной биологии, Сингапур.vlad@imcb.a-star.edu.sg
В общем асимметрия мозга представляет собой частный случай
асимметрии всего организма, но может возникать и независимо от
остальных частей тела. Это предполагает существование
регуляторных генов ответственных за формирование симметрии как
всего организма, так в частности и мозга. В настоящее время
изучение формирование каскадов регуляторных генов проводят на
модельных животных. Небольшая аквариумная рыбка данио (Danio
rerio)
была применена в лабораторных исследованиях в качестве
генетической модели в США в 1989-х годах. В настоящее время она
широко используется во всем мире. Привлекательность данио в
качестве модельного организма может быть отнесена за счет
сравнительно небольшого генома, относительного короткого периода
репродукции (3-4 месяца), практически стремительного развития
вне материнского организма (всего несколько дней) и почти
неограниченного количества оптически прозрачных эмбрионов
получаемых еженедельно от каждой самки (200-1000). Эта модель
используется для массового изучения паттернов экспрессии
регуляторных генов в процессе развития мозга.
Сигнальный каскад регулируемый геном Нодал (Nodal)
является одним из самых ранних в развитии животных и его
нарушения у мышей после нокаута вызывают раннюю гибель зародышей
вследствие отсутствия мезодермы. У данио эта функция зависит по
крайней мере от двух генов – более раннего
Squint
и более позднего
Cyclops,
роли которых частично перекрываются. Несколько лет тому назад в
моей лаборатории ген
Cyclops
был клонирован. Оказалось, что он экспрессируется как а зачатках
осевых органов так и асимметрично в левой половине латеральной
мезодерме и позже в левой части эпиталамуса соответствующей
хабенуле (habenula)
(Sampath
et al.,
1998; Фиг. 1). Эта статья по сути дела предопределила
направление исследований в этой области на несколько последующих
лет. Стало ясно, что латерализация всего тела и в том числе
мозга зависит от генов таких как
flh
(floating
head)
и
ntl
(no
tail
–
Brachyury)
связанных с «организатором», формированием первичной оси
организма и потоком жидкости в организаторе (у млекопитающих)
или Купферовом пузырьке (у рыб).
Транспозон
Tol2
активен даже когда размер всей конструкции достигает 10 тыс.пар
оснований.
Tol2относится
к семейству транспозонов
hAT
(hobo/Ac/Tam3).
Модифицированный неавтономный
Tol2
в присутствии
Tol2
транспозазы приобретает способность перемещаться в геноме
половых клеток данио (Kawakami
et al.,
2000). К настоящему времени создан мини-Tol2,который
состоит из терминальных повторов каждый из которых включает чуть
более 200 пар оснований. Мини-Tol2
способен без потери эффективности трансгенеза переносить вставки
порядка 10 т. п. о. (Steve
Ekker,
personal communication).
Недавно транспозон
Tol2
был применен в нашей лаборатории для поиска энхансеров (Parinov
et al.,
2004). Для этого в
Tol2
был вставлен ген зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) под
контролем относительно слабого мини-промотера
эпителий-специфичного кератина-8. После инъекции ДНК
транспозона на плазмиде в присутствии РНК транспозазы и инсерции
транспозона энхансеры проявляют себя посредством экспрессии
гена-маркера, например кодирующего флуоресцентный белок. Эта
конструкция обладает сравнительно низким фоном базальной
экспрессии ЗФБ вероятно из-за присутствия слабого промотера. В
то же время она довольно чувствительна в отношении энхансеров;
75% рыб - первичных носителей трансгена дали начало трансгенным
линиям с ярко выраженной тканеспецифической экспрессией ЗФП вне
кожи при относительно высоком уровнем экспрессии по сравнению с
другими конструкциями. Так в нашей лаборатории в небольшом по
масштабам пробном трансгенном скрининге энхансеров мы наблюдали
эффективность трансгеноза на уровне 16% отобрав более 30
интересных трансгенных линий. Идентификация мест вставки
транспозона в геном производилась путем ПЦР.
И хотя в каждой из трансгенных линий экспрессия ЗФП может
выявлять только частичный паттерн экспрессии определенного гена,
все вместе эти линии предлагают многочисленные возможности
изучать формирование различных типов клеток и органов. Вдобавок
цитоплазматическая локализации ЗФБ позволяет детальный анализ
клеточной архитектуры включая самые тонкие отростки клеток,
например, нейриты. Следовательно ЭТ линии представлют собой
замечательные орудия для детального анатомического анализа. С их
помощью уже удалось идентифицировать и описать анатомические
структуры ранее неизвестные у данио.
Количество ЭТ линий постоянно растет поскольку ими уже начали
пользоваться в качестве «стартовых площадок» для инициации
транспозиции транспозона в новое положение после инъекции в
эмбрионы этих линий мРНК транспозазы (Parinov
et al.,
2004). Имея ввиду легкость идентификации места инсерции
транспозона этот метод предоставляет возможность создания карты
примерного расположения энхансеров в геноме и таким образом
позволяет глубже понять роль некодирующих участков ДНК.